La fase oscura della fotosintesi

La fase oscura comprende il ciclo di Calvin e la sintesi degli zuccheri.
Benchè si chiami fase oscura, il ciclo di Calvin avviene prevalentemente di giorno, data la maggiore disponibilità di ATP e NADPH prodotti dalla fase luminosa, ma per un breve lasso di tempo può continuare anche in assenza di luce. Infatti il ciclo di Calvin ha bisogno dei prodotti della fase luminosa per avvenire, ovvero ATP e NADPH, quindi un’assenza di luce prolungata causerebbe la mancanza di questi prodotti e, di conseguenza, impedirebbe l’intero processo della fase oscura.
L’obiettivo della fase oscura è quello di sintetizzare gli zuccheri a partire dal G3P (gliceraldeide 3-fosfato), un prodotto intermedio del ciclo di Calvin.

La scoperta del ciclo di Calvin 
Ciò che oggi sappiamo sulle reazioni della fase oscura della fotosintesi si deve per gran parte al lavoro, durato più di dieci anni, di un gruppo di scienziati dell'Università della California diretti da Melvin Calvin.
Essi volevano chiarire in che modo dall'anidride carbonica, un composto a un atomo di carbonio, la cellula possa sintetizzare composti a più atomi di carbonio. La ricerca iniziò nel 1946. Soltanto allora, infatti, divenne disponibile ai biologi una tecnica infallibile per seguire le vicende degli atomi di carbonio: fu scoperto l'isotopo radioattivo del carbonio, con numero di massa 14 (¹⁴C), che può essere utilizzato come tracciante.
Il concetto era semplice: fornendo alle cellule fotosintetiche ¹⁴CO₂, cioè anidride carbonica contenente il tracciante radioattivo, la radioattività si sarebbe poi ritrovata in tutte le molecole di cui essa andava a far parte. Per lo studio fu usata l'alga verde unicellulare Chlorella, un organismo piccolo, visibile soltanto al microscopio ma semplice da coltivare.

Il procedimento sperimentale
Si procedeva in questo modo: un campione di alghe veniva posto in un recipiente di vetro pieno d'acqua e illuminato.
Poco dopo vi si faceva gorgogliare ¹⁴CO₂ e, nel giro di qualche secondo, le alghe venivano uccise con alcol etilico bollente all'80% (in queste alghe unicellulari l'alcol penetra immediatamente nella cellula, bloccando il processo fotosintetico).
Contemporaneamente, la soluzione alcolica estraeva dalle cellule anche i composti prodotti dalla fotosintesi.
A questo punto si trattava di scoprire in quale dei composti prodotti si trovavano atomi di ¹⁴C, riconoscibili per la loro radioattività. Si dovevano separare i composti estratti con una tecnica di cromatografia ed eseguire una autoradiografia, che permettesse di identificare la posizione del composto contenente ¹⁴C.

I risultati 
Soltanto verso la metà degli anni 1950 si capì che il composto a tre carboni, era il risultato della rottura di un composto a sei atomi di carbonio, formato quando la CO₂ si lega al ribulosio bisfosfato a 5 atomi di carbonio.
Si capì perciò che le reazioni procedevano in modo ciclico, rigenerando sempre il ribulosio.

Ciclo di Calvin 
Questo processo, che avviene nello stroma del cloroplasto, è diviso a sua volta in 3 fasi:
• Fase di fissazione del carbonio: essendo un processo circolare il prodotto finale è anche un reagente della prima reazione.
Infatti la prima reazione avviene tra la C02 derivante dagli stomi e il RuBP (ribulosio 1,5-bisfosfato) dalla quale si ottengono 2 molecole di 3-fosfoglicerato (3PG); la reazione è catalizzata dall’enzima RuBisCO

C₅H₁₂O₁₁P₂ + CO₂ + H₂O → C₃H₇O₆P

• Riduzione e produzione di zuccheri in cui la 3PG reagisce con un’ATP tramite una fosforilazione per ottenere una molecola a tre atomi di carboni con 2 gruppi fosfato, ovvero 1,3-bisfosfoglicerato.
In seguito avviene una ossidoriduzione con NADPH per ottenere una molecola di G3P, a cui è stato sottratto un gruppo fosfato, e un NADP⁺

C₃H₇O₆P + ATP → C₃H₈O₁₀P₂ + ADP
C₃H₈O₁₀P₂ + NADPH + H⁺ → C₃H₇O₆P + NADP⁺ + HPO₄^2-

• Dopo queste reazioni si ha il G3P e questo può percorrere 2 strade alternative: la sintesi di zuccheri o la rigenerazione di RuBisCO.
Con 6 cicli di Calvin si ottengono 12 G3P, 2 dei quali vengono utilizzati per sintetizzare una molecola di glucosio, mentre gli altri 10 per la rigenerazione di RuBisCO tramite una serie di reazioni nelle quali viene consumato ATP.

La reazione completa netta del ciclo di Calvin, dopo aver annullato il ribulosio 1,5-bifosfato, è:

6 CO₂ + 12 NADPH + 12H⁺ + 18 ATP → 12 NADP⁺ + C₆H₁₂O₆ + 18 ADP + 18 P_i

Si prendono in considerazione 6 cicli di Calvin perché sono quelli necessari per ottenere una molecola di glucosio. Ma come si ottiene tale molecola?
Il G3P è un prodotto intermedio della glicolisi, che avviene anche nelle piante, quindi il G3P viene trasformato in piruvato per poi ottenere glucosio.
Il G3P, però, può anche essere convertito in amido, che poi verrà depositato nei tessuti di riserva e, infine, una parte di G3P è trasformata in saccarosio che viene trasferito negli altri organi della pianta dove avverrà l’idrolisi e si utilizzeranno glucosio e fruttosio per ottenere altri composti organici come amminoacidi, lipidi e acidi nucleici.

RuBisCO
La ribulosio-1,5-bisfosfato carbossilasi/ossigenasi (spesso abbreviata come RuBisCO) è un enzima, appartenente alla classe delle liasi, che catalizza la seguente reazione:

D-ribulosio 1,5-disfosfato + CO₂ + H₂O → 2 3-fosfo-D-glicerato + 2 H⁺ 

La RuBisCO assume una notevole importanza a livello biologico, in quanto, tramite la fissazione del carbonio, è il principale produttore di materia organica nell'ecosistema terrestre.
Dal momento che le reazioni catalizzate dalla RuBisCO rimangono ancora piuttosto lente, le piante producono quantità enormi di questo enzima, che, da solo, raggiunge circa il 25% di tutto il materiale proteico presente nei cloroplasti e il 50% di quello dello stroma.
Di conseguenza è stato osservato che la RuBisCO è l'enzima più abbondante presente sulla Terra, a dimostrazione del fatto che la fotosintesi messa in atto dagli organismi vegetali (piante, ma anche alghe e batteri come per esempio i cianobatteri) sia la reazione più comune e di maggiore importanza per la vita sul nostro pianeta.
La capacità della RuBisCO di agire sia come carbossilasi sia come ossigenasi permette la continua produzione di fosfoglicolato.
L’enzima però ha una diversa affinità con le molecole di CO₂ e O₂, infatti è più facile che catalizzi la reazione con il diossido di carbonio e, solo in caso di scarsa quantità di quest’ultimo, catalizza maggiormente la reazione con l’ossigeno. Infatti la temperatura influenza questo aspetto perché ad alte temperature gli stomi vengono chiusi e, quindi, lo scambio di CO₂ con l’esterno cessa e quello rimanente viene consumato finchè la concentrazione di ossigeno diventa tale da superare l’ostacolo dell’affinità.


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